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        實驗技巧┃石蠟切片技術的前前后后,你確定都了解?

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        從今天起小編將會不定時像大家分享一些分子實驗室常用的實驗技巧,之前我們有分享過關于細胞培養、RNA提取、qPCR常見問題等內容干干干干貨!為什么你提取的RNA總是被降解?師姐心血之作 | 成功培養細胞的技巧都在這里了;老司機帶你輕松玩轉qPCR,問題、異常統統搞定!點擊鏈接即可跳轉至內容,今天呢我們分享的主要內容是關于石蠟切片相關實驗的一些注意事項和技巧。

        石蠟切片技術的發展方便了很多科研人員對樣本的需求,通過石蠟包埋的樣本可以保存數年,并且對保存環境要求不嚴格,這對于科研人員來說是極大的便利。石蠟包埋的原理是新鮮的樣本組織,通過石蠟處理,將石蠟代替了組織中的水分,從而制成切片,并能良好的保存組織和細胞的結構。石蠟切片前期制作較為復雜,包括取材、固定、洗滌和脫水、透明、浸蠟、包埋┉┉封片等步驟,較為繁瑣。

        具體實驗步驟:

         

        取材

        根據不同的實驗目的,選擇相應的樣本,及時放入盛有固定液體的標本瓶中,組織要求新鮮,擱置時間過久則產生蛋白質分解變性,導致細胞自溶及細菌的滋生,而不能反映組織活體時的形態結構。

         

        固定

        固定液的種類很多,其對組織的硬化收縮程度以及組織內蛋白質、脂肪、糖類等物質的作用各不相同。固定液的用量一般為材料的10~15倍或稍多,常規固定時間為12~48h(根據組織塊大小而定),固定能使組織硬化,有利于后續實驗順利進行。

         

        洗滌與脫水

        固定后的組織材料需除去留在組織內的固定液及其結晶沉淀,否則會影響后期的染色效果,可以用流水沖洗數小時,使用酒精或就是混合液固定的材料,不需要洗滌,可直接進入脫水環節,脫水是為了因為水和透明劑不互溶,用酒精脫水后可讓透明劑進入組織,可用70%、85%、95%、100%濃度的乙醇進行脫水,脫水時間根據組織快大小而定,一般1-2小時,如果不能及時進行梯度脫水,要將組織放入70%的乙醇中保存。

         

        透明

        酒精和石蠟不互溶,用二甲苯替換出組織內的酒精。用的透明劑有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等,各種透明劑均是石蠟的溶劑,可先用一半的無水乙醇和一半二甲苯混合液浸漬,在換成二甲苯兩次共40min~2h(根據組織塊大小而定)。

         

        浸蠟與包埋

        是為了讓石蠟浸入組織替代透明劑,起支持作用,以便包埋。將熔化蠟倒人包埋盒,用溫鑷子夾取組織塊放入盒的中央位置,待石蠟全部凝結變硬即可取出。

         

        修切蠟塊

        把包埋好的蠟塊用刀片修切成正方形或長方形,注意勿太靠近組織,讓組織四周留有少許石蠟,蠟塊兩邊必須切成平行的直線,以免切下的蠟條彎曲。

         

        固定蠟塊

        取小木塊,用蠟鏟在酒精燈上加熱,使石蠟塊底面熔化一層粘于小木塊上,冷卻后裝在切片機上。

         

        載玻片

        取干凈的載玻片涂以甘油蛋白:以玻璃棒尖端稍取甘油蛋白一滴,輕輕滴于載玻片中央,常以洗凈的手指加以涂布,涂布的面不宜太廣,而以恰恰能夠貼附蠟片為度。甘油蛋白不能涂布過多,否則,會形成白膜,妨礙觀察。

         

        切片

        注意刀的傾角,切片厚度一般為5-8μm,用毛筆托住蠟帶,放在展片盒內(水溫宜在48°C左右)展片,刀片的鋒利度與石蠟塊的軟硬直接影響切片質量。

         

        貼片

        蠟帶受熱即自動展開,也可用撥針輕輕拉開。待蠟片完全展平后,用濾紙吸去多余水分。注意切片和載玻片之間不能有氣泡,否則在展片時氣泡會擴大,甚至致使切片破損、變形,影響組織觀察。

         

        烤片

        將貼片置人37~62℃恒溫干燥箱干燥12h。干燥后片子常溫、陰涼處保存待實驗時用。

         

        以上是關于石蠟切片的相關技術操作,其實在實驗中,石蠟切片技術是不容易掌握的,經常會由于一些未知的因素導致切片質量差,影響后續實驗,所以下面小編將在切片過程中常見的一些問題及解決方法大致羅列一下,希望對大家的科研有所幫助。

         
         

        end

         

         


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