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        干干干干貨!為什么你提取的RNA總是被降解?

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        “大風起兮云飛揚,蒼天佑我效率強”,以前上學的時候,每每提取RNA之前,都要默念幾遍(我太難了。RNA提取怕是所有分子實驗室的必備的技能了,但是提取的效果可能經常會有些不盡人意,忽好忽壞。

        今天我們就來說說提取RNA被降解的那些事兒。

        RNA樣品特別容易受到環境因素影響,組織取出后沒有馬上處理或冷凍;待提取rna的樣品沒有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃;細胞在用胰酶處理時過度;溶液或離心管未經Rnase去除處理,這些都會導致辛苦提出的RNA被降解,特別是大名鼎鼎的RNA酶 (RNase),通常我們全副武裝、小心翼翼,但還是會受到RNA酶的降解,核糖核酸酶(RNase)或稱RNA酶,是一種可將RNA水解成小分子組成的核酸酶。RNase作為一個小分子的蛋白,卻異常的穩定。常規的高溫高壓蒸汽滅菌和蛋白抑制劑都不能使它完全失活,聽著就很頑固。

        除了具有極佳的穩定性,RNA酶在實驗室無處不在。它是生物的一種防御機制,對于一個細胞來說外源性的RNA往往是致命的,相比于外源性的DNA,外源性的RNA往往更加危險,一不注意外源性的RNA就愉快的轉錄翻譯了,所以幾乎所有的生物都進化出了RNA酶用來防御外源性RNA的入侵。因此實驗室培養的細菌細胞以及提取RNA的你都散發著RNA酶的香氣,人類的體液(唾液、眼淚等)甚至手指中都含有大量的RNA酶,所以操作時要戴好口罩,盡量避免與人交談,還要做到勤換手套。

        其次,操作時使用的儀器、耗材,包括槍頭、離心管、移液器也要確保是無RNA酶的,剛剛說了單純的滅菌是不能滅活RNase的,所以槍頭和離心管要用DEPC處理,也就是說使用表明是DEPC處理的產品。移液器最好是有一套專用的,使用之前用75%的酒精擦拭干凈,尤其是桿子。使用的水、緩沖劑要確保無RNA酶,使用的實驗臺面最起碼要用75%的酒精擦拭,反正就是你實驗過程中所用到的各種儀器設備,你都要對它了如指掌。

        樣本選擇時一定要選取新鮮的樣本組織或者取樣后迅速低溫處理(液氮速凍);樣本出現多次反復凍融后,RNA得率會嚴重下降,也會導致RNA降解;對于血液樣本,如果樣本中含有血塊,說明樣本收集時未加入血液抗凝劑;建議重新收集樣本并加入EDTA,肝素,檸檬酸等抗凝劑;

        最后歸納一下:低溫是關鍵,耗材處理好,全副武裝少說話!

        祝大家提的RNA濃度高,純度好,實驗順順利利。


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